在多器官芯片平臺(tái)上模擬人體血管系統(tǒng)

Tobias Hasenberg1,2, Katharina Schimek1, Severin Mühleder3, Andrea Dotzler1, Sophie Bauer1, Alexandra Lorenz1, Wolfgang Holnthoner3, Heinz Redl3, Roland Lauster1, Uwe Marx1,2

1TU Berlin, Institute for Biotechnology, Gustav-Meyer-Allee 25, 13355 Berlin, Germany

2TissUse GmbH, Markgrafenstra?e 18, 15528 Spreenhagen, Germany

3Ludwig Boltzmann Institute for Experimental and Clinical Traumatology, Donaueschingenstra?e 13, 1200 Vienna, Austria

背景介紹

我們的多器官芯片平臺(tái)（MOC）有助于正在進(jìn)行的體外物質(zhì)測(cè)試系統(tǒng)的發(fā)展，最終目標(biāo)是取代動(dòng)物模型。雙器官平臺(tái)（2OC）包括獨(dú)立的電路，每個(gè)電路包含兩個(gè)獨(dú)立的培養(yǎng)腔，可用于任何3D組織構(gòu)建的組合。這些空腔通過(guò)微流體通道相互連接。集成的芯片上的微泵提供微升規(guī)模的脈動(dòng)血流循環(huán)。每個(gè)流路僅有600 μL的微量體積，可通過(guò)豐富的介質(zhì)在培養(yǎng)腔之間實(shí)現(xiàn)自分泌和旁分泌的交互調(diào)節(jié)。

人造血管在這個(gè)測(cè)試平臺(tái)中非常重要。這不僅是因?yàn)樗鼈冊(cè)诠?yīng)組織方面的作用，而且作為內(nèi)皮屏障與介質(zhì)成分相互作用，并調(diào)節(jié)其向下層組織的擴(kuò)散。嘗試在培養(yǎng)腔內(nèi)重建連續(xù)的單層內(nèi)皮細(xì)胞。

研究介紹

圖1：微粒子圖像測(cè)速技術(shù) （μPIV）。（A）雙器官型號(hào)2OC的底部圖。系統(tǒng)的蠕動(dòng)灌注系統(tǒng)是由微流泵對(duì)三個(gè)連續(xù)排列的膜進(jìn)行周期性的降低和提升來(lái)實(shí)現(xiàn)的。芯片內(nèi)的容積流量可以通過(guò)外部施加到膜上的驅(qū)動(dòng)頻率、壓力和真空來(lái)控制。不同于傳統(tǒng)的μPIV ，我們將紅細(xì)胞（RBCs）引入微流泵芯片而不是聚合微珠中。使用高速CMOS相機(jī)（Baumer HXC40）與標(biāo)準(zhǔn)光學(xué)顯微鏡連接，在可接觸的位點(diǎn)（a）和（b）獲取連續(xù)成像。使用PIVlab對(duì)圖像進(jìn)行分析，甚至當(dāng)可見排列在通道壁上的內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）等細(xì)胞，箭頭表示流動(dòng)的方向。（B）使用血紅細(xì)胞進(jìn)行輻射μPIV分析，正速度表示運(yùn)動(dòng)，如圖（a）中的箭頭所示。數(shù)據(jù)被評(píng)估以優(yōu)化引入的內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）s上的剪切力，然后建立一種類似生理的脈動(dòng)血流循環(huán)。

圖2：微流體通道的內(nèi)皮化。（A）將HDMECs（人真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞）接種到雙器官平臺(tái)（2OC）的通道中。Calcein AM實(shí)驗(yàn)可實(shí)時(shí)監(jiān)控在4天的脈動(dòng)血流過(guò)程之中，在循環(huán)的所有區(qū)域的細(xì)胞活力和分布。（B） VE-Cadherin， （C） CD31（紅色）和vWF（綠色）的表達(dá)表明正常的內(nèi)皮細(xì)胞生理行為。（D）微通道內(nèi)HDMECs（人真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞）的橫截面，CD31（紅色）和vWF（綠色）染色。HDMECs（人真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞）能夠覆蓋所有通道的墻壁，形成一個(gè)緊密的層。（E）EC的肌動(dòng)蛋白絲在靜態(tài)和（F）動(dòng)態(tài)培養(yǎng)條件下。只有后者顯示出應(yīng)力纖維束沿流向排列。（B）至（F）圖像中核用Hoechst復(fù)染（藍(lán)色）。

圖3：ECs排列（定位角度）和形態(tài)（形狀指數(shù)）。4天后，在點(diǎn)（a）和（b）靜態(tài)和動(dòng)態(tài)條件下，比較HDMECs（人真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞）的排列和形態(tài)。ECs隨流動(dòng)方向遷移、增殖和定向。

圖4：創(chuàng)建三維類器官共培養(yǎng)的血管床。（A）HUVECs（人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞）與脂肪來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞（ASCs）在纖維蛋白支架內(nèi)共培養(yǎng)。用GFP轉(zhuǎn)染HUVECs。盡管有動(dòng)態(tài)環(huán)境和細(xì)胞活性，纖維蛋白凝膠在14天內(nèi)保持形狀和穩(wěn)定。（B）放大視圖。微血管在3 - 7天內(nèi)形成。脈動(dòng)血流循環(huán)并不影響血管的形成。

圖5：血管床的三維組織。用雙光子顯微鏡獲得的z堆疊的渲染圖。分支的z位置是用顏色編碼的——顏色較深的分支更靠近玻璃底部。在纖維蛋白凝膠的內(nèi)部可見分支的微血管，因此可見整個(gè)突出的支架。凝膠大約有3.5毫米厚。

研究總結(jié)

微流體通道的內(nèi)皮化是為任何生物衍生物重建生理環(huán)境的第一步。復(fù)雜的雙器官平臺(tái)（2OC）設(shè)計(jì)使HDMECs在接近生理?xiàng)l件下培養(yǎng)40天，并為ECs提供了合適的剪切應(yīng)力環(huán)境。典型EC標(biāo)記CD31、vWF和VE-cadherin的產(chǎn)生證實(shí)了培養(yǎng)物具有正常的細(xì)胞行為。

μPIV測(cè)量用來(lái)表征和優(yōu)化芯片的流動(dòng)動(dòng)力學(xué)。與聚合珠相比，紅細(xì)胞顯著地阻止顆粒偶爾粘附于通道壁、細(xì)胞或細(xì)胞殘留物。

HUVECs與纖維蛋白支架的結(jié)合創(chuàng)造了尚未充血性的微血管。三維重建了血管的基本結(jié)構(gòu)和特征，為未來(lái)的器官整合奠定了基礎(chǔ)。此外，我們?cè)O(shè)想從大的人造血管（圖2）到最小的自發(fā)形成的微毛細(xì)血管（圖5）建立一個(gè)連續(xù)的內(nèi)皮屏障。這對(duì)于類器官（共）培養(yǎng)中的生理相互作用、調(diào)節(jié)和穩(wěn)態(tài)穩(wěn)定至關(guān)重要。此外，它是在芯片使用血液的先決條件。

北京佰司特科技有限責(zé)任公司 

類器官串聯(lián)芯片培養(yǎng)儀-HUMIMIC；灌流式細(xì)胞組織類器官代謝分析儀-IMOLA；光片顯微鏡-LSM-200；

蛋白穩(wěn)定性分析儀-PSA-16；單分子質(zhì)量光度計(jì)-TwoMP；超高速視頻級(jí)原子力顯微鏡-HS-AFM；

全自動(dòng)半導(dǎo)體式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀-SOL COUNT；農(nóng)藥殘留定量檢測(cè)儀—BST-100；臺(tái)式原子力顯微鏡-ACST-AFM；微納加工點(diǎn)印儀-NLP2000/DPN5000；