應(yīng)用案例（質(zhì)量光度計-MP）：質(zhì)量光度計測量蛋白質(zhì)的變性

Characterization of protein interaction equilibria

翻譯整理：北京佰司特科技有限責(zé)任公司

質(zhì)量光度計量化了溶液中生物分子的質(zhì)量分布。在自然條件下，已確定其用于分析生物樣品的純度、完整性和功能。然而，其在變性條件下的性能尚未得到*評估。在本申請說明中，我們證明質(zhì)量光度計是研究低聚物蛋白質(zhì)變性（去折疊）和復(fù)性（再折疊）的有用工具。通過化學(xué)變性破壞蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)可以深入了解蛋白質(zhì)和復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性。尿素和鹽酸胍（GdnHCI）等化學(xué)變性劑通過改變蛋白質(zhì)疏水殘基暴露于周圍水溶液中，促進蛋白質(zhì)的變性（去折疊）。雖然化學(xué)變性在生物化學(xué)研究中已經(jīng)用了幾十年，但由于其涉及大量分析技術(shù)，操作成本高，靈敏度低，數(shù)據(jù)分析和解釋太復(fù)雜，因此對變性（去折疊）和復(fù)性（再折疊）的監(jiān)測仍然具有挑戰(zhàn)性。

在本應(yīng)用說明中，我們探討了質(zhì)量光度計（MP）的功能，以快速獲得有關(guān)蛋白質(zhì)去變性（去折疊）和復(fù)性（再折疊）的直觀結(jié)果。與所有MP應(yīng)用一樣，測量過程只需極少量樣品，就可以方便地測試各種變性條件。為了舉例說明MP在非折疊/復(fù)性實驗中的優(yōu)勢和局限性，我們對烯醇化酶進行了研究，這是一種已知可進行可逆變性的蛋白質(zhì)。

質(zhì)量光度計對結(jié)構(gòu)不敏感

MP是一種超靈敏的單分子顯微鏡技術(shù)，用于檢測玻璃-水界面溶液中蛋白質(zhì)（或其他生物分子）的散射信號。落在該界面上的粒子散射的光量取決于粒子的質(zhì)量，而不是其形狀。無論蛋白質(zhì)是折疊的還是未折疊的，其質(zhì)量都保持不變，MP讀數(shù)也保持不變。

我們在天然和變性條件下對烯醇化酶的MP測量表明MP對蛋白質(zhì)折疊狀態(tài)不敏感。在自然條件下，烯醇化酶主要形成約93 kDa質(zhì)量的二聚體和一些約46 kDa質(zhì)量的單體。在變性條件下（尿素），二聚體分離成大部分未折疊的單體。然而，正如預(yù)期的那樣，未折疊單體的質(zhì)量（通過MP測量（?46 kDa））與折疊單體的質(zhì)量相同（圖1）。MP對折疊狀態(tài)的不敏感使其成為監(jiān)測折疊相關(guān)寡聚的可行方法。

高濃度變性劑會影響光學(xué)測量

蛋白質(zhì)去折疊實驗通常在非常高濃度的變性劑下進行。然而，當(dāng)尿素和GdnHCI在水溶液中濃度較高時，會形成氫鍵聚集。這種團簇可以用MP觀察到，因為聚集體的光學(xué)性質(zhì)不同于周圍溶液的光學(xué)性質(zhì)。這種差異導(dǎo)致背景光散射，在比率MP圖像中表現(xiàn)為圖案（圖2）。隨著尿素濃度的增加，圖案及其相應(yīng)的信號也增加，直到濃度超過1M尿素時達到平臺（圖2）。

來自聚集體的圖案信號表示背景噪聲，這將使使用MP測量生物分子的質(zhì)量更加困難。MP測量的散射信號甚至可能不再是可量化的，尤其是對于接近探測下限的較小物體。因此，在使用變性劑時，檢查背景信號非常重要，這將為實驗設(shè)置噪聲基線。以下章節(jié)描述了如何使用稀釋去除變性劑背景信號。

質(zhì)量光度計揭示復(fù)性動力學(xué)

當(dāng)變性劑背景被稀釋時，MP可以對變性過程提供有價值的分析，從而可以監(jiān)測低聚蛋白質(zhì)的復(fù)性動力學(xué)。烯醇化酶在自然條件下主要是二聚體，在變性條件下24小時后幾乎*是單體。當(dāng)變性烯醇化酶樣品通過PBS稀釋回到接近自然條件時，MP質(zhì)量分布圖捕捉到了這種變化（圖3）。稀釋后立即進行第一次測量，這得益于MP的快速性及其在寬質(zhì)量范圍內(nèi)準(zhǔn)確執(zhí)行的能力。

我們還能夠使用MP監(jiān)測變性烯醇化酶樣品的復(fù)性動力學(xué)，顯示二聚體在稀釋后的最初60分鐘內(nèi)逐漸重新形成（圖3）。二聚體回復(fù)動力學(xué)可以通過繪制單體/二聚體比率隨時間的函數(shù)來可視化。回收率取決于所使用的變性物質(zhì)，用GdnHCI變性的烯醇化酶恢復(fù)得更快（圖4）。回復(fù)過程提供了有關(guān)蛋白質(zhì)相互作用以及不同變性物質(zhì)如何影響蛋白質(zhì)相互作用的重要信息。

這項研究表明，即使在未折疊狀態(tài)下，MP也能提供有關(guān)生物分子和復(fù)合物的質(zhì)量和組成的寶貴信息。MP提供了一種簡單的方法來監(jiān)測多聚體復(fù)合物中蛋白質(zhì)的變性和復(fù)性過程，并很容易比較變性劑的效果。